外泌体质量评估关键技术：NTA、BCA与WB全面解析

外泌体作为细胞间通讯的重要媒介，近年来在疾病诊断、治疗监测和药物递送等领域展现出巨大潜力。然而，如何准确检测和鉴定外泌体却成为科研工作者面临的首要挑战。本文将深入解析外泌体检测的三大核心技术——纳米颗粒追踪分析(NTA)、BCA蛋白定量和Western blot(WB)检测，帮助读者全面了解外泌体表征的技术要点与最新进展。

▲示意图 | 来源网络

外泌体是直径30-150nm的纳米级囊泡，具有典型的"杯托状"或"茶托形"形态。由于外泌体分离过程中难以获得完全纯净的样品，且目前没有任何单一技术能够全面评估外泌体的存在、数量和完整性，国际共识推荐必须联合多种检测方法进行综合鉴定。

电镜、NTA和WB已成为外泌体鉴定的"金标准"组合，三者优势互补：电镜观察形态但无法定量；NTA提供粒径分布却无法确认身份；WB检测标志蛋白但不能反映完整性。只有当这三种实验结果一致（电镜看到典型结构、NTA显示30-150nm粒径分布、WB检测到标志蛋白富集），才能确认成功分离到外泌体。

▲电镜下的外泌体 | 图片来源网络

NTA技术通过光散射原理和布朗运动追踪，能够快速测定样品中纳米颗粒的粒径分布和颗粒浓度。这项技术不破坏样品原始状态，检测速度快，已成为外泌体研究中不可或缺的工具。

NTA利用光学显微镜直接观察纳米颗粒的散射光信号，通过跟踪其布朗运动轨迹，结合Stokes-Einstein方程计算颗粒大小。现代NTA仪器如qNano Gold系统采用可控电阻式脉冲感应(TRPS)原理，检测范围可达40nm-10μm，精度高达1nm，并能测定颗粒表面电荷。

 ● 提供群体粒径分布特征，确认样品是否符合外泌体定义(30-150nm)

 ● 测定颗粒浓度，评估分离效率

 ● 检测速度快，样品需求量少（仅需40μL）

▲NTA技术原理示意图 | 来源网络

在进行WB检测前，必须通过BCA法准确测定外泌体样品的总蛋白浓度，这是确保后续实验可比性和重复性的关键步骤。

 ● BCA(Bicinchoninic Acid)法与铜离子还原反应结合，生成紫色复合物，通过比色法定量

 ● 相比Bradford法，BCA对去垢剂耐受性更好，适合外泌体样品

 ● 需要根据样本类型调整标准曲线范围样本要求：

 ● 血浆样本：建议总量≥60μg，浓度>0.5μg/μL

 ● 细胞上清：建议总量≥40μg，浓度>0.5μg/μL

WB通过抗原-抗体特异性结合原理，检测外泌体标志蛋白，从分子水平确认外泌体成分的存在。

 ● 阳性标志物（至少3个）：

    • 跨膜蛋白：CD9、CD63、CD81（至少选择1个）

     • 胞质蛋白：TSG101、Alix、HSP70（至少选择1个）

 ● 阴性标志物（至少1个）：

     • 内质网蛋白：Calnexin

     • 细胞核蛋白：Histone 3

     • 高尔基体蛋白：GM130

 ● 证实外泌体特定成分的存在

 ● 通过多标志物组合提高鉴定特异性

 ● 设备要求相对较低，实验室普遍可开展

外泌体研究的可靠性始于严谨的鉴定流程。NTA、BCA和WB作为核心检测指标，各有侧重又互为补充，共同构建了外泌体鉴定的质量体系。随着新技术不断涌现，外泌体检测正朝着更灵敏、更快速、更精准的方向发展，为外泌体在疾病诊断和治疗中的转化应用奠定坚实基础。

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