外泌体：从质量标准到技术应用的规范化探索

外泌体作为一种由细胞分泌的纳米级囊泡，凭借其独特的生物学特性和广泛的应用潜力，正成为生命科学、医学等领域的研究热点。随着研究的不断深入，建立统一、规范的质量标准及配套鉴定方法，成为推动外泌体从实验室走向产业化应用的核心前提。

▲示意图 | 来源网络

国际上，国际细胞外囊泡学会（ISEV）分别于2014年、2018年及2024年发布三版《细胞外囊泡国际指南》，为外泌体研究提供了持续更新的方法论框架和操作规范。2019年，新加坡细胞外囊泡临床研究与转化学会（SOCRATES）、国际细胞外囊泡学会（ISEV)、国际细胞与基因治疗学会（ISCT）、国际输血学会（ISBT）等学会的专家联合发表了《Defining mesenchymal stromal cell (MSC)-derived small extracellular vesicles for therapeutic applications》，提出了对于干细胞来源的外泌体应建立可定量化评价其生物学特性的方法及参考物质，为该领域的研究与应用指明方向。

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在国内，标准建设同样稳步推进。2021年3月，中国细胞生物学会标准工作委员会发布6项干细胞领域团体标准；2022年9月，我国牵头制定并发布干细胞国际标准ISO24603。这些标准涵盖科研、临床和产业等多个维度，为干细胞来源外泌体标准的制定奠定了坚实基础。此后，国内相继出台多项相关团体标准，从制备、检验等多方面进行规范。

▲表1 | 国内细胞外囊泡（含外泌体）相关团体标准

综合已发布的标准，外泌体质量标准主要涵盖以下关键质量属性：

 ① 形态：通过透射电镜观察，外泌体呈现茶托状或杯状的双层膜结构，中央低电子密度成分分布集中且边界清晰。

 ② 粒径：粒径需小于200nm，主要分布在30-150nm范围内，且该区间存在粒径峰值。

 ③ 标志蛋白：需满足特定组合，即CD9、CD63、CD81中任意两个表达阳性，Alix、Tsg101中任意一个表达阳性，Calnexin、histone3、GM130中任意两个表达阴性。

 ④ 颗粒蛋白比：颗粒数与蛋白量的比值不低于1×10⁸particles/μg。

 ⑤ 安全性指标：包括无菌检查（真菌、细菌等微生物阴性）、支原体检测阴性、细胞内外致病因子（如HIV抗体、HBsAg等）检测阴性、内毒素含量小于0.5EU/ml，以及异常免疫学反应检测中淋巴细胞亚群无异常增殖。

为确保外泌体质量符合标准，一系列专业鉴定方法应运而生，从不同维度对外泌体进行精准表征：

采用纳米流式检测法(FlowNanoAnalyzer)和纳米颗粒跟踪分析（NTA)。

 ● A：纳米流式检测法（FlowNanoAnalyzer）是基于鞘流单分子荧光检测技术开发的一种先进的单颗粒、多参数、高通量的纳米颗粒定量表征。纳米流式检测仪覆盖了传统流式细胞仪200nm以下粒径检测的盲区，囊括了纳米颗粒以及亚细胞结构，可实现单个纳米颗粒(7-1000nm)的粒径及其分布检测。

 ● B：纳米颗粒跟踪分析（NTA)：对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。

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透射电子显微镜观察法（TEM）可从形态和大小上对外泌体进行鉴定，采用负染技术，在高倍镜下直接观察单个外泌体的形态和大小。

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纳米流式检测和流式细胞仪可快速检测CD63、CD9、CD81等表面标志蛋白的阳性表达，适合高通量筛选。

此外WB检测可检测跨膜蛋白（如CD9、CD63）、溶质蛋白（如TSG101、Alix）等阳性标志物，以及内质网蛋白Calnexin、细胞核蛋白histone3或高尔基体蛋白GM130的阴性标志物。

无菌检测依据《中华人民共和国药典》（2020年版三部/四部）中的<1101 无菌检查法>和<3301 支原体检查法>；细胞内外致病因子检测采用ELISA法检测抗体水平，核酸检测法检测病毒核酸；内毒素检测参照《中华人民共和国药典》（2020年版三部/四部）<1143 细菌内毒素检查法>；异常免疫学反应检测通过CFSE标记法结合流式细胞术检测淋巴细胞增殖率。

质量标准的迭代与鉴定技术的创新，共同构建了外泌体规范化发展的“双支柱”。未来，随着跨学科技术的融合与多领域研究的深入，外泌体质量标准将更加精细化、国际化，鉴定方法也将向更高效、更精准的方向突破，为其在疾病诊断、靶向治疗、再生医学等领域的突破性应用铺平道路，推动这一“纳米级信使”真正走进临床实践与产业创新的广阔天地。