外泌体分离纯化：从实验室到产业的技术革新

外泌体作为生物医学领域的 “明星分子”，在疾病诊断、药物递送和再生医学等方面展现出巨大潜力。而外泌体的分离与纯化，正是解锁其价值的关键一步。从实验室的科研到工业化的规模生产，一系列高效技术正让外泌体的获取变得更精准、更高效、更可控。

外泌体的分离技术主要依据其固有的物理化学属性，涵盖尺寸大小、质量分布、表面特有的蛋白质标记、表面电荷以及密度差异等特征。目前科研领域主流分离提取方法有超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、免疫磁珠法、聚合物沉淀法、分子排阻法、阴离子交换层析及微流控芯片法等。下表简单列举不同外泌体分离纯化方法的原理及优缺点：

▲表1 | 常用外泌体分离纯化技术汇总

外泌体制备方法众多，根据制备样本的体量和最终的应用场景，可以选用不同的外泌体制备方法。

超速离心法因其纯度高、操作标准化，被公认为外泌体提取的“金标准”。其制备流程如下：

▲超速离心法分离外泌体流程

①样品前处理

从细胞上清中分离外泌体：收集细胞悬液，先300g离心10min，将细胞和培养上清分离；再2000g离心10min去除死细胞；离心上清转移至新管，10000g离心30min去除细胞碎片。

②超速离心

将预处理后的样品装入超速离心管，以100000g，4℃，离心70min；弃上清，用预冷PBS重悬沉淀，然后进行二次超速离心，即100000g，4℃，离心70min；弃上清，重悬底部沉淀即为外泌体。

③外泌体保存

短期4℃保存；-80℃长期保存，注意避免反复冻融。

超速离心分离外泌体虽然有其优势，但由于操作复杂耗时，离心的高转速可能损伤外泌体，且难以满足工业化大体系生产需求，因此工业化外泌体制备需采用新工艺流程。

在工业化生产中，外泌体由于分离和纯化难度较大，故外泌体的产量在一定程度上决定着临床应用的广泛性。目前细胞外泌体的分泌量难以满足工业化需求，需通过技术手段放大生产。研究表明，缺氧、饥饿、氧化应激、剪应力、加热、电刺激等处理都会增加外泌体产量。

工业化生产中，外泌体来源广泛，原料多以体液形式提供，含核酸、蛋白等杂质，要确保外泌体分离的通量、产出量和纯度是关键。目前外泌体领域已经从纯粹的科学研究转向了产业化，在工业化放大生产中主流方案如下：

切向流过滤联合阴离子交换层析可实现大规模外泌体纯化，蛋白去除率超99.97%。

▲外泌体超滤-层析工艺流程

注：图片来源于《Distinguishing functional exosomes and other extracellular vesicles as a  nucleic acid cargo by the anion-exchange method》

①复合模式层析纯化：

使用Crysto shell 400（兼具阴离子交换与疏水功能）复合模式层析介质，吸附宿主细胞杂质，外泌体因分子量大被排阻在外直接流穿。（注：Crysto shell 400相比Capto Core 400孔径更小，可确保回收率。）

② 离子交换层析纯化：

使用MoSphere 70X DEAE/Q超大孔阴离子交换层析介质，进行外泌体的精纯。（注：MoSphere 70X DEAE/Q具有微米级孔径，载量更高，传质速度更快。）

▲注：图片来源于科诺赛生物

① 疏水层析纯化：

使用Butyl Chromrose 4FF疏水层析介质，去除宿主细胞等杂质。

② 离子交换层析纯化：

使用MoSphere 70X DEAE/Q 超大孔阴离子交换层析介质，捕获外泌体。（注：MoSphere 70X DEAE/Q 具有微米级孔径，载量更高，传质速度更快。）

▲注：图片来源于科诺赛生物