脂质体制剂制备工艺及质量控制研究进展

1965年Bangham等首次发现，将磷脂分子分散在水性溶液中，磷脂分子会自发形成封闭的双层囊泡，随后，由磷脂双分子层构成的封闭球状囊泡被称之为脂质体。脂质体的发现引起了科学家们的广泛的兴趣。脂质体内的亲水环境可以包裹亲水性药物，而构成脂质体的磷脂分子层之间则可以装载亲脂性药物。脂质体作为载体具有生物膜结构，免疫原性低，能够延长药物半衰期，降低药物毒性，并且可提高药物传递效率。自脂质体获得研究学者们关注的五六十年来，通过对脂质体的处方设计、结构修饰、制备工艺的进一步创新，传统脂质体的稳定性差、包封率低等问题被逐渐解决，脂质体在药物递送方面的应用不断被拓展，涵盖了抗肿瘤、抗真菌、镇痛、疫苗及光动力疗法等多个治疗领域。近几年来，我国多家药企也成功开发并上市了几种脂质体制剂，如紫杉醇脂质体注射液、多柔比星脂质体注射液，两性霉素B脂质体注射液等。由于不同的处方及制备工艺对脂质体药物的安全性和有效性会产生不同的影响，因此了解脂质体药物的关键质量属性并建立有效的质量控制策略十分有必要，本文结合国内外已上市的脂质体产品，对脂质体药物的制备工艺及系统的质量评价方法进行综述，为脂质体给药技术的开发和质量评价提供参考。

要想使脂质体制剂达到良好的临床效果，离不开对脂质体制备工艺的研究，药物制备工艺的微小变化会对脂质体制剂的安全性和有效性产生重要的影响。薄膜水合法、溶剂注入法、复乳法、主动载药法、微流体技术等均为脂质体的制备方法，用于生产不同粒径、结构和功能的脂质体药物。

1.1 薄膜水合法

薄膜水合法是制备脂质体的传统方法之一，该方法是将脂质和有机溶剂如氯仿混合，通过旋转蒸发或其他方法去除有机溶剂，在形成的脂质薄膜中加入亲水性介质如磷酸盐缓冲液，脂质则自发水合聚集形成非均质化的较大粒径的脂质体，且通常为多层结构，通过结合超声和膜挤压法可以减小脂质体粒径，得到粒径较为均一的脂质体。虽然该方法较为成熟，设备简单，但由于方法使用了有害的有机溶剂，如氯仿和甲醇，这些化学物质的残留物可能会留在最后的脂质体制剂中，造成潜在的毒性。为了避免有毒试剂的使用，Mortazavi等提出采用改进的加热法制备脂质体，将脂质体的各组成成分二棕榈酸磷脂酰胆碱（DPPC）、双十六烷基磷酸（DPC）、胆固醇分别在磷酸盐缓冲液中室温下水合2h，然后在胆固醇混悬液中加入甘油（3%，v/v），加热到120℃并搅拌20min，随后将温度降低至60℃，将脂质体的其他组成成分加入到胆固醇混悬液中，搅拌后放置室温30min脂质体即可形成。该方法不涉及有毒试剂的使用，无需高剪切力的均质化和超声处理，制备的阴离子脂质体-Ca²⁺-DNA三元复合物的包封率高达81%。如今，除了传统的薄膜水合法，已经衍化出了多种快速、无需有机溶剂、无需均质化处理的水合法。

1.2 溶剂注入法

溶剂注入法是将磷脂和胆固醇溶解在乙醇或乙醚中制成有机相，在磁力搅拌下用注射泵将有机相注入一定体积的水相中，当有机溶剂和水相接触时脂质体因其避水作用而自发形成，最后通过旋转蒸发去除脂质体中的有机溶剂。脂质浓度、搅拌速度、注射流量、溶剂的注入量、温度等参数均会影响脂质体粒径。例如，Jaafar-Maalej等采用乙醇注入法成功制备了包裹亲脂和亲水性药物的脂质体制剂，并研究了关键工艺参数和配方参数对脂质体的影响，结果表明，水相的搅拌速率和有机相中磷脂的浓度是影响脂质体大小的关键参数。Gentine等采用优化后的乙醇注入法，将含有脂质的乙醇溶液加热至60℃（高于脂质的相转变温度），注入到70℃的水相中，搅拌后乙醇通过旋转蒸发去除。该优化的乙醇注入法能够有效的控制脂质体粒径，结果显示当乙醇的体积比为33%（v/v）时，脂质浓度、脂质电荷和水相类型对囊泡直径影响不大。

1.3 复乳法

复乳法又叫二次乳化法，是指将脂质溶于适量有机溶剂并按比例加入少量水相，超声或震荡后得到W/O的乳化液，然后再加入大量水相溶液，进行第2次乳化，得到W/O/W的乳化液，最后通过旋转蒸发去除多余的有机溶剂和水相即可。复乳法是制备多囊脂质体的常用方法，Luo等通过复乳法制备了齐墩果酸多囊脂质体，在体内和体外均表现出缓释的效果；Sun等通过Depofoam复乳法制备的盐酸纳曲酮多囊脂质体，体内研究表明血药浓度能较恒定地保持在10ng·mL^-1以上约120h。美国制药公司推出的一项多囊脂质体制备技术的专利———Depofoam技术中就采用了复乳法，该技术开发20多年来成功应用于多个上市脂质体制剂，如阿糖胞苷脂质体注射液、硫酸吗啡缓释脂质体注射液、布比卡因脂质体注射液等。由复乳法制备的多囊脂质体，由于结构的特殊性，其粒径较普通脂质体的粒径更大，通常在5~50μm范围内。

1.4 主动载药法

上述的脂质体制备方法均为被动载药法，而主动载药法是利用脂质体内外水相的pH梯度或离子梯度，使水溶性或两亲性药物主动跨过脂质分子层进入脂质体内部水相中。主动载药法对水溶性药物和两亲性药物具有较高的包封率。pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等均是用于包封弱碱性和弱酸性药物的脂质体制备方法。在主动载药法中，跨膜梯度（pH梯度/离子梯度）、孵育温度和时间、药脂比、药物油水分配系数的对数值（logP）和酸度系数（pKa）等均为主动载药的影响因素。多柔比星脂质体制剂DoxilⓇ采用了硫酸铵梯度法制备，包封率达到97%左右。FDA批准上市的伊立替康脂质体Onivyde^Ⓡ、阿糖胞苷和柔红霉素复合脂质体Vyxeos^Ⓡ等也均采用主动载药法制备。

1.5 微流体技术

由于传统的脂质体生产方法如薄膜水合法、溶剂注入法主要依赖于脂质在溶剂中的自发聚集，该过程是不可控的，因此合成的脂质体是多分散和多层的，通常需要通过挤压、超声或高压均质化进行进一步的处理。而微流体技术是一种多功能的脂质体制备技术，脂相和水相在不同的入口通过1个直径数十至数百微米的通道，脂相流在水动力作用下聚焦成1个狭窄的薄片，通过调整水相和脂相的体积流速比、流体通道的长度、温度、混合条件、脂质浓度，实现可变的脂质体粒径（几十纳米到几百微米）和较窄的粒径分布。Elsana等分别采用薄膜水合法和微流体法制备了新型阳离子脂质体，结果表明，与薄膜水合法制备的脂质体相比，微流体法制备的脂质体具有更小、更均匀的粒径和Zeta电位，并且包封效率更高。Deng等利用表面活性剂辅助的微流体技术制备单分散的单室和多室脂质体，实现了高产率、高通量地生产单层和多层脂质体。

1.6 超临界流体技术

由于超临界流体（通常选用经济无毒的CO₂）在临界点具有气、液两相的特点，即黏度低，密度大，有良好的流动性和溶解特性，在脂质体制备方面有着特殊的优势。超临界流体可用作脂质的溶剂或分散剂，当作为溶剂时，能够代替有机溶剂的使用，使脂相与水相结合，通过改变压力和温度使CO₂成为气体而除去，从而避免有机溶剂在终产品中的残留；当作为分散剂时，分散在纯水中的脂质通过超临界流体加压，使脂质在介质中由于碰撞和剪切力而分散得更好。不仅如此，超临界流体技术具有快速简单的一步制备过程，通过对重要参数如脂质浓度、分散体积、压力和温度等的控制，能够制备并且工业化生产具有特定理化性质的脂质体。多种超临界流体技术已经应用于脂质体的制备，如注射减压法、超临界反溶剂法、超临界溶液快速膨胀法、超临界流体逆相蒸发法等。为了简化两性霉素B脂质体的制备方法，降低生产成本，Lim等采用超临界反溶剂法制备了两性霉素B脂质体，粒径在100~150nm，包封率约90%，且冻干前后脂质体的粒径、包封率、粒径分布均无明显变化，由此表明，用该方法制备的脂质体粒径均一，稳定性强，可作为制备两性霉素脂质体的潜在方法。

随着脂质体用于药物递送研究的不断发展，为了规范化脂质体药物的研发和上市审批过程，EMA和FDA均发布了相关的技术指南和要求。FDA指南中指出，脂质体制剂的理化性质包括脂质体形态、表面特征如聚乙二醇（PEG）化、表面电荷、粒径和粒径分布、相转变温度、药物包封率与载药量、体外释放率、泄露率等，能够反映药物的安全性和有效性，以上理化参数的改变将会导致药物质量的变化，因此在脂质体制剂的研发和生产过程中需要严格控制其理化参数尤其是关键质量属性的变化。

2.1 脂质体的表面电荷

脂质体的表面电荷会影响脂质体的硬度、稳定性和聚集状态，用带电荷的脂质制备脂质体时，由于静电斥力的存在，脂质体稳定性良好，不易发生聚集；而在体内，表面电荷也会影响脂质体的肿瘤靶向性和细胞摄取过程。由于生物膜的负电性，阳离子脂质体能促进脂质体与生物膜的融合，从而有利于包封药物的释放，但也可能由于被包封药物的性质而影响与生物膜的相互作用。Hoffmann等发现，将核酸包裹于带正电荷的膜融合脂质体中，核酸的细胞转染效率很低，这可能是由于带负电荷的核酸和阳离子脂质体的相互作用减弱了脂质体与细胞表面的相互吸引，从而降低了核酸向胞内的转移。将核酸和带正电荷的分子组成复合物中和了核酸的负电荷后，脂质体的膜融合和核酸转染效率大大增加。表面电荷的测定方法通常有电泳法、电渗法及超声波法，Zeta电位常被用于评估脂质体的表面电荷特征，Smith等考察了Zeta电位对带电脂质体的敏感性，采用不同的带电脂质制备阳离子、阴离子和中性脂质体，发现Zeta电位值与脂质体内带电脂质摩尔百分比之间有很强的线性关系，并且，在pH分别为7.7、5.8、3.8的条件下测定脂质体的Zeta电位时，随着pH的降低，脂质体的Zeta电位负值逐渐减小，这说明在酸性条件下带电脂质的质子化程度增强；而在不同浓度的氯化钠溶液（0.01、0.02、0.03mol·L^-1）中测定时，随着离子强度的增加，脂质体的Zeta电位负值也逐渐减小。以上结果表明，测量环境的pH、离子强度的微小变化会对Zeta电位产生很大的影响。

2.2 脂质体的粒径大小和分布

脂质体的粒径可以从几十纳米到几十微米不等，这取决于不同的制备方法和实际应用。脂质体的大小和粒径分布是脂质体的重要理化特性，会对药物的载药量和体内药代动力学产生影响，包括细胞摄取、组织分布和循环半衰期等。粒径过大，会导致微粒被吞噬的速度加快，循环时间缩短；粒径过小则药物包封率降低，释放加快，渗透性增加。同时，在脂质体的靶向性方面，Joshi等发现200nm的阳离子脂质体比80nm的阳离子脂质体的肿瘤组织靶向性更高，这是因为在一定粒径范围内，较大的颗粒表面积与肿瘤血管内皮的黏附作用更大。Ong等研究了脂质体粒径对灰黄素脂质体口服生物利用度的影响，结果表明，较小尺寸的脂质体生物利用度比较大尺寸的脂质体高约3倍，但继续降低脂质体粒径（400nm以下）不会改善药物的生物利用度。除此之外，有研究表明不同粒径的脂质体颗粒还会诱导不同的免疫反应。

脂质体的粒径分布可以通过多种仪器技术进行分析，2020年版《中华人民共和国药典》中收载了原料药和制剂的粒度和粒度分布测定法，包括显微镜法、筛分法、光散射法147。对于单分散的脂质体，应用广泛的微粒检测技术包括基于光谱的激光衍射、动态光散射技术以及基于显微成像的扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜等。对于多分散脂质体，也有许多结合粒径的分离技术共同用于脂质体尺寸分布的表征，如尺寸排阻色谱、毛细管电泳技术等，Singh等采用了一种多光谱的高级纳米颗粒跟踪技术，可以准确测量50~2000nm的多分散样品中的颗粒大小。

2.3 脂质及其降解产物的测定

磷脂和胆固醇是构成脂质体的重要非活性成分，大豆卵磷脂（SPC）、氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰甘油（DPPG）等均是已上市脂质体制剂中常用到的磷脂类化合物，磷脂和胆固醇的比例能调节脂质体膜的流动性和相变温度，从而影响脂质体的形状、包封率和体内的渗透率。然而，磷脂在生产和贮存过程中容易发生水解反应，产生降解产物溶血磷脂和脂肪酸，在人体正常情况下，溶血磷脂在细胞膜中的含量≤3%，浓度范围是12~166μmol·L^-1，当溶血磷脂浓度过高时，会导致细胞膜破裂，产生溶血或细胞坏死，因此检测脂质体中胆固醇、磷脂及其降解产物的含量是很有必要的。由于胆固醇和磷脂类化合物极性小且无紫外吸收，不能使用常规的紫外检测器检测，文献中报道的检测方法是采用通用型检测器进行测定：示差折光检测器（RID）、蒸发光检测器（ELSD）、电喷雾检测器（CAD）等。彭佩等采用HPLC-ELSD法同时测定了复合磷脂脂质体中SPC、HSPC和胆固醇的含量，结果表明该方法精密度和回收率高，能够快速、准确地测定上述脂质的含量。李晗等采用HPLC-CAD法对长春瑞滨热敏脂质体中的溶血磷脂进行检测，和其他通用检测器相比，电喷雾检测器无需对待测组分进行前处理，灵敏度高，对复杂组分和微量降解产物均可达到检测要求。

2.4 包封率

包封率是评价纳米载体的重要参数，包封率的大小会直接影响用药的剂量和药物在体内的疗效。脂质体的组成成分和比例、包封药物的性质以及制备工艺均可影响脂质体包封效率。脂质体的包封率是指包裹在脂质体中的药量占总药量的百分比，测定包封率时，关键的一步是将脂质体制剂中的游离药物和脂质体分离而不造成脂质体的破坏，张艺等就脂质体包封率的前处理方法进行了详细介绍，包括离心法、透析反透析法、葡聚糖凝胶柱法和微柱离心法等。

不同的分离方法会对包封率的测定产生不同的影响，有研究表明，在采用尺寸排阻色谱、固相萃取法、离心超滤法、中空纤维离心超滤法测定两性霉素B脂质体包封率时，4种方法的测定结果有很大差异，测得包封率结果分别为93%、5%~13%、100%、99%，采用固相萃取法结果明显降低的原因在于，C₁₈固定相容易吸附脂质体表面的脂质，导致游离药物与脂质体的分离效果变差，包封率降低。因此在选择分离方法时需要综合考虑包封药物、脂质体成分以及分离介质的相互作用，如在离心法中，游离的水溶性药物因其良好的溶解性会分布于上清液中，而脂质体则位于沉淀中；相反，对于脂溶性药物，在较低的离心强度和短的离心时间下，游离药物不溶于水而沉淀，脂质体位于上清液中；对于多囊脂质体的包封率测定，由于其较大的粒径，采用低速离心法能较好地将游离药物分离并防止脂质体的破坏。除了上述方法，为了提高包封率测定结果的准确度，LV等采用实时成像技术对待测的纳米载体进行荧光探针标记，当探针分子结合在纳米颗粒中时，会发出近红外荧光，当纳米载体降解时，它们被释放到周围的水介质中，荧光立即熄灭，以荧光强度测定包封率，并评价了离心法、超滤法和凝胶渗透色谱的分离能力。结果表明，离心法有明显的粒径和尺寸依赖的分离趋势，适用于粒径和密度大的纳米载体的包封率测定，超滤法和凝胶渗透法对纳米载体的分离效果都较好，但凝胶渗透法对药物的回收率较差。

2.5 体外释放度

脂质体在体内发挥药效的前提是包封药物的有效释放，药物在脂质体中的释放速率是影响其药理作用和药代动力学的重要因素，如Yanagida等研究表明，通过优化法舒地尔脂质体的释放率可提高法舒地尔治疗脑缺血/再灌注损伤的疗效。影响脂质体体外释放率的因素包括脂质体制剂本身的特性以及制备工艺和测定方法。Hioki等发现，在阿霉素脂质体体外释放试验中，聚乙二醇化脂质体表现出比非聚乙二醇化脂质体更高的释放率。Khatib等通过喷雾干燥法制备环丙沙星纳米晶脂质体，蔗糖含量高的脂质体配方对环丙沙星脂质体的释放时间延长，并依此制成了可吸入的、药物释放可控的环丙沙星脂质体。脂质体的体外释放行为也是仿制药一致性评价的一项重要内容，如创新药两性霉素B脂质体AmBisome^Ⓡ与其仿制药Anfogen^Ⓡ和Lambin^Ⓡ相比虽然有相同的配方组成，但药物有效性和安全性均不及原创药，究其原因是仿制药中两性霉素B的快速释放。因此，建立合理有效的体外释放度测定方法对于脂质体制剂的安全有效性和仿制药开发有重要意义。目前的测定方法有取样-分离法、膜扩散法、新型的测定方法以及各国药典中收载的释放度测定方法的改进方法。

2.5.1 取样-分离法

取样-分离方法是使用最为广泛和简便的方法，具体操作是将脂质体混悬液置于透析袋中并溶于适宜的释放介质，通过水浴静置或搅拌、摇床震荡使脂质体释放，以预先设好的时间取样并分离或过滤，测定释放药物的含量。由于方法简便，成本低廉，取样分离方法适用于药物体外释放度的前期考察，通过选择不同的温度、释放介质、搅拌速率或震动频率来初步确定药物释放的条件。如高文慧等就采用取样-分离方法研究了长循环吗啡脂质体的体外释放特性，将长循环吗啡脂质体置于透析袋中并在含有磷酸盐缓冲液的释放介质中搅拌，分别于0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48h取样后离心取上清液，计算药物累积释放率。

2.5.2 反透析-桨法

透析法和反透析法区别在于待释放药物是置于透析袋内还是透析袋外的释放介质中，透析法是检测从透析袋内释放到介质中的药物，而反透析法是检测从介质中释放入透析袋中的药物。为了探讨多囊脂质体的释放机制，Manna等以已上市的长效局麻药布比卡因多囊脂质体（Exparel^Ⓡ）为研究对象，采用与反透析法相结合的桨法建立了一种新的体外释放度测定方法，并利用原位光纤UV-Vis探头置于透析袋内，实时检测药物的释放情况。和取样-分离法相比，新方法能更好地控制释放条件，得到药物突释、延滞期和二次释放的3步释放过程，阐释了多囊脂质体的释放机制，探讨了温度、pH、搅拌速度、释放介质等因素对多囊脂质体体外释放度的影响。

2.5.3 柱切换HPLC法

传统的离心、过滤或透析方法可能会影响药物的释放过程，例如药物在离心或过滤过程中释放，透析膜的释放限制，释放条件不易控制等，在实验过程中需要考虑这些因素的影响。Ohnishi等建立了柱切换HPLC法，能够分别测定阿霉素脂质体中的包封药物和释放的药物（游离药物），将阿霉素脂质体以合适的浓度分散在HPLC玻璃瓶中，在预定温度和时间取样注入柱切换HPLC，游离药物通过分离柱时被保留，而包封药物被洗脱下来经过萃取柱进行萃取和分离，最终游离药物和包封药物分别通过分离柱和萃取柱分离，经过分析柱的洗脱和分析后用紫外检测器检测，和传统的透析方法相比，不存在膜渗透导致的释放限制，也不需要复杂的前处理过程，不仅可以测定释放率，还可以分析脂质体的包封行为。

2.5.4 流池法

流池法对于研究难溶性药物和特殊剂型的体外释放行为有独特的优势。相较于其他溶出方法，流池法有应用于不同剂型的样品池和可供选择的流速，并且根据药物特性，释放介质可采用开环或闭环模式，在体外释放度测定方面有广阔的应用前景。已有文献报道了采用流池法测定脂质体体外释放度的方法，如Tang等利用流池法测定了两性霉素B脂质体的体外释放度，通过考察释放介质的种类和比例，释放介质温度和流速，起始药物浓度等因素，使两性霉素B在没有沉淀或脂质体结构降解的情况下于24h内释放，建立的该方法能有效区分两性霉素B原研制剂和2个仿制药品的释放行为。同样地，Yuan等也采用流池法考察了多柔比星脂质体的体外释放行为，可用于区分不同制备工艺的多柔比星脂质体的体外释放特征。

2.6 微生物控制

由于脂质体药物的给药途径以肠道外给药为主，因此无菌检查、微生物限度检查、热原和细菌内毒素检查等对于评价脂质体制剂的安全性和免疫毒性很重要。由于脂质体特殊的结构和性质，给脂质体制剂的微生物控制带来了一系列挑战。如在脂质体生产中，传统的灭菌技术如加热灭菌、化学灭菌和射线灭菌法对脂质体的灭菌具有一定的局限性，可能导致脂质体泄露、微粒聚集以及脂质降解等问题，而超临界流体由于其化学惰性，对细菌、病毒、芽孢等具有强大的灭活能力并能实现低温灭菌，在医疗器械、天然生物材料、食品的灭菌过程中均有所应用，或许可以成为脂质体灭菌的潜在方法。《中华人民共和国药典》规定静脉用注射剂应按各品种项下的规定进行热原和细菌内毒素的检查，并符合规定，然而，脂质体在一定情况下会干扰鲎试剂的测定，因此需要选择并开发针对纳米微粒的细菌内毒素检测技术。如潘卫松等在探讨多西他赛脂质体的细菌内毒素的检测方法时，直接采用细菌内毒素检查用水（BET检查用水）溶解稀释样品，会对鲎试剂的检测有增强干扰的作用，而用60%乙醇溶液溶解样品再用BET检查用水稀释数倍后，不再产生干扰。孙丹在检测依托泊苷脂质微球注射液的细菌内毒素时同样采用了此方法。这可能是由于细菌内毒素，即革兰阴性细菌外壁的脂多糖能够和脂质体表面的脂质结合，干扰鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应而影响实验准确度，而60%乙醇溶液或表面活性剂能够溶解并破坏脂质结构，避免了脂质对鲎试剂的干扰。同时，也有报道采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）检测脂多糖结构中的羟基脂肪酸，建立了一种没有纳米颗粒特异性干扰的灵敏的细菌内毒素检测方法。