精准评估mRNA完整性对于获得可靠的基因表达数据至关重要，如在临床和分子研究中的RT-qPCR或RNA测序分析表达谱。由于mRNA仅占RNA总量的5%，而核糖体RNA（rRNA）占了最大的比重，因此评估mRNA完整性的技术应该是针对mRNA本身。另外，RNA提取的污染物也可能导致检测偏差。
RNA完整性最早通过检测琼脂糖凝胶上的28S和18S rRNA条带来进行评估，但该技术上样量大(~300ng)、耗时、无法准确定量且不确定性强。毛细管电泳系统出现后，实现了用快速、可重复和自动化的方式进行RNA完整性评估，但很大程度上评估的是核糖体18S和28S RNA而不是mRNA本身的定量和完整性，因此作为完整性指标存在争议。基于3':5'的逆转录定量PCR (RT-qPCR) 可以直接测定mRNA的完整性，成为毛细管电泳的替代方法，但标准曲线的使用和PCR抑制剂的存在导致方法过程繁琐和结果的不稳定。本实验首次通过数字PCR技术可以对mRNA进行完整性检测，同时实现绝对定量，由比利时根特大学和澳大利亚的科学家在《Analytical Biochemistry》发表了题为“Development of a 3':5' digital PCR assay to determine horse mRNA integrity”的文章。文中采用3':5'的三重数字PCR直接绝对定量检测方法，基于naica®微滴芯片数字PCR系统完成马的mRNA完整性分析，整个方法快速准确、直观简便，为mRNA完整性评估提供极具应用意义的检测新方法。- 开发了一种快速，直观，简便的三重数字PCR 3':5'测定法，用于评估马样品中的mRNA完整性。
- 数字PCR检测可以同时对mRNA进行准确定量，不受抑制物影响。
- 数字PCR检测灵敏度高，不依赖标准曲线，同时特别适合少量样本。
3':5'的PCR方法需要设3组引物/探针，分别用于扩增靶标基因的3'端、中心和5'端序列(如下图所示)。由于逆转录酶在断点后无法继续转录，因此 mRNA的完整性直接影响三个区域中每个区域的逆转录。完整性高的mRNA 3':5'拷贝数浓度比例接近1：1，而完整性低的mRNA 5'端拷贝数浓度会比3'端少，3':5'的比值更高。
3'：5'三重数字PCR检测mRNA完整性的原理示意图
三组引物和探针分别针对所选基因的3 '端、中心和5 '端，具有高完整性的mRNA会转录所有区域，而完整性差的mRNA只会转录3 '区域(红色信号)。本研究使用以PGK1作为靶序列，该基因编码磷酸甘油酸激酶-1，RNA分离后，对照组使用加热或酶解的方式对RNA进行降解。逆转录结束后使用预先设计的针对3'端、中心端和5'端和3对引物/探针进行三重数字PCR扩增检测。3'：5'三重数字PCR检测mRNA完整性的扩增子距离示意图多重引物探针设计和方法优化可登陆Gene-π数字PCR在线资源中心通过基于naica®微滴数字PCR系统的三重数字PCR检测方法，将24个样本的检测结果与对应的RIN值进行数据拟合分析，验证实验结果。通过线性回归模型校正分析相关性，通过数据集进行稳健回归以检验异常值。数据表明，3':5'三重数字PCR检测结果的线性回归分析具高拟合度(蓝色R2)，是评估RNA完整性的可靠方法。
3 ':5 'naica三重数字PCR检测结果相关性研究。1)去除异常值（红色）的线性回归模型(蓝色)，2)整个数据集的稳健回归模型(橙色)。
本研究中开发了一种 3':5' 三重数字PCR检测方法，使用更快速、直观、简便数字PCR方法研究mRNA的完整性。数字PCR检测结果与RIN结果高度相关。本文首次证明数字PCR 是评估RNA完整性的一种有应用前景的新方法。而且数字PCR 可以实现绝对定量，因此同时可以用于评估逆转录mRNA 的实际用量。
1.Charis Du Cheyne,Development of a 3’:5’ digital PCR assay to determine horse mRNA integrity,Analytical Biochemistry,Volume 626,2021,114217,2.The dMIQE Group, J.F. Huggett, The digital MIQE guidelines update: minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments for 2020, Clin. Chem. 66 (2020) 1012–1029.3.https://www.gene-pi.com/tutorials/
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本文章来源于细胞与基因治疗领域
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