双载体AAV基因疗法又一进展，突破大基因组限制

OTC缺乏症是一种罕见的遗传性代谢疾病，由负责氨解毒的肝酶的遗传缺陷引起。患者的尿素循环障碍，血液中积聚过量的氨，可能导致一系列后果，包括不可逆转的神经损伤、昏迷和死亡。早发性严重OTC缺乏症的唯一治疗方法是肝移植，整体而言，目前这一疾病尚缺乏有效的治疗手段。

GTP-506是一款利用双载体AAV递送的基因疗法，其中一个是靶向表征良好的PCSK9基因位点，能进行基因编辑的ARCUS核酸酶载体（GTP-506A）；另一个是治疗性供体载体（GTP-506D），能够插入健康的OTC基因以提供所需的疾病校正。该基因编辑疗法在PCSK9位点进行切割，然后在该位置上插入治疗基因，从而表达健康的基因。

2022年10月，iECURE公布的GTP-506的临床前数据显示，非人灵长类动物给药一年后，ARCUS核酸酶能够稳定插入治疗基因；OTC缺陷小鼠在接受治疗后进行高蛋白饮食挑战后免受致命的高氨血症的影响，整体而言药物的耐受性良好。

此外，还有其他企业也正在开发双载体AAV基因疗法，并取得了一系列进展。

DB-OTO是Decibel与Regeneron合作开发的一款双载体AAV基因疗法，为了解决OTOF基因过大而超载荷的问题而利用两个AAV载体分别装载OTOF cDNA的不同基因片段，将其传递到细胞内以表达Otoferlin蛋白，从而促进患者恢复听力。这一疗法能够采用耳蜗内注射给药。

目前，这一疗法已经被英国药品和保健产品监管机构（MHRA）批准进入临床，也是欧洲首个获批进入临床的针对Otoferlin基因的基因疗法，预计在2023年上半年启动临床试验并于2024年第一季度公布首批患者的临床数据。

OTOF-GT也是一种双载体AAV基因疗法，利用双AAV2 quadY-F OTOF载体能够将Otoferlin基因递送到细胞中而恢复由OTOF基因突变引起的感音神经性听力损失。

2022年12月，OTOF-GT被FDA授予孤儿药资格认定，并预计于2023年上半年提交OTOF-GT的临床试验申请。

AK-OTOF的设计原理也是利用两种AAV携带OTOF基因的不同片段，表达时通过基因片段的自修复，在细胞内完成全长OTOF基因的表达。礼来在2022年10月以12.50美元/股的价格收购了Akouos，加码基因疗法。目前，该疗法处于1/2期临床试验阶段。

鼎新基因是国内率先采用AAV双载体递送技术的基因治疗公司，其研发的RRG-003也是一款双载体AAV基因疗法，鼎新基因选择了最合适的AAV亚型、表达原件以及重组位点，克服了OTOF基因较大的挑战。

目前，鼎新基因与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院合作的治疗先天性耳聋AAV基因疗法RRG-003已启动临床试验，这是国内开展的首个用于治疗耳聋的基因疗法临床试验。

EDIT-103是一种CRISPR/Cas9的体内基因编辑疗法，用于治疗视紫红质相关的常染色体显性视网膜色素变性（RHO-adRP）。该疗法旨在使用双AAV5载体递送来敲除和替换视紫红质基因中的突变以保持感光器功能，可通过视网膜下注射给药，有望解决150多种可导致RHO adRP病的RHO功能获得型的突变。

在基因疗法中，可能会遇到基因组太大的问题，而将大基因组进行拆分，由两个或三个单独的AAV载体携带，再在细胞内重组整个大基因表达框，表达完整的大蛋白是一个有效的解决方式。除了对基因组进行拆分外，还可以对AAV进行改造，仍利用单个AAV载体传递大基因。

在包装超大基因组时，达到最大包装容量或遇到终止信号时包装即会停止，从而产生包含不同大小的异质片段基因组的AAV载体，当这些AAV载体将基因传递到靶细胞时，片段基因组的同源重组会恢复表达框并介导大蛋白的表达。整体而言，片段化基因传递方式效率较低，但在肌肉和视网膜中，这一方式的传递比多重AAV载体更有效，如在传递大基因MYO7A时，单个AAV片段基因传递的表达较高。

另外，已有研究表明，衣壳改造能够优化单个AAV载体递送大基因组。如VP2衣壳蛋白的缺失和HBoV1衣壳蛋白改造均能够提高AAV载体的包装能力。

而除了改造单个AAV载体外，基于蛋白剪接的方法也能够使利用AAV载体高效递送大基因成为可能。SpliceBio开发了一种蛋白剪接平台，可以利用工程化的内含肽，催化高效的蛋白剪接，在体内重建所需的全长治疗性蛋白，这一过程与RNA剪接类似。

目前，SpliceBio利于这一平台研发用于治疗Stargardt病的AAV基因疗法，计划将一个大小为6.8kb的ABCA4基因分成两部分，分别表达携带内含肽的部分蛋白，然后内含肽在细胞内介导蛋白剪接，合成具有功能的全长蛋白。

AAV基因疗法在疾病治疗中颇具潜力，目前有些疾病所需的基因组过大而成为AAV基因疗法应用的一大障碍。从企业布局来看，大部分涉及大基因组包装的企业在攻克耳聋，且主要集中在双载体AAV治疗由OTOF基因突变引起耳聋方向。不过随着研发的深入，AAV载体能够携带的基因组将可能进一步扩大，届时这一疗法也将适用于更多疾病的治疗。

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本文章来源于细胞基因疗法