丽山生物提升慢病毒工艺收率实战揭秘—膜分离黑科技

（1）收获/澄清

贴壁体系的料液为细胞培养上清，含有少量的细胞或细胞碎片，料液浊度相对较低。此次收获料液的初始浊度为26NTU。

滤器测试结果分别从滤后收率、浊度和载量三个方面进行分析，结果如图2所示。不同滤器澄清料液的收率均在90%以上，孔径越小，收率越高。Sartopure PP3 0.45μm 滤器对料液浊度的处理效果最佳，滤后料液浊度小于10NTU，更有利于后续工艺的进一步处理。从载量上来看，玻纤材质的滤器载量最高，其次是聚丙烯材质的滤器。综合比较可以看出，对于贴壁料液或浊度较低的料液，可以通过Sartopure PP3 0.45μm滤器进行一步澄清，既保障了澄清工艺的收率和载量，同时料液的降浊效果也可满足工艺要求。

图2 不同滤器澄清后料液浊度、收率、载量的比较结果

此外，悬浮培养的收获料液，因含有大量的悬浮细胞或细胞碎片使得料液浊度较高，通常可达数百NTU。对于此类料液，通常有两种处理方案，一种是离心+澄清过滤（如离心+Sartopure PP3 0.45μm），另一种是多种不同孔径的滤器组合进行多级过滤（如Sartopure PP3 8μm +Sartopure PP3 0.45μm）。通常在料液体积较小时选择第一种方案，操作便捷高效；当料液体积增大后，考虑到大型离心机的成本投入以及一次性工艺的可扩展性，更多的会选择多级滤器组合使用。

（2）超滤

澄清后的病毒料液中含有核酸酶、宿主细胞蛋白等杂质，通过超滤浓缩换液可以在减少料液体积的同时，去除部分小分子量杂质并置换为层析缓冲液，为后续层析纯化工艺做准备。此外超滤也可以应用在层析工艺后，置换为慢病毒保存液，提高病毒稳定性。

中空纤维和膜包是慢病毒超滤工艺中常用的超滤介质。本实验中我们在赛多利斯SARTOFLOW smart超滤系统中通过优化剪切力、切向流速、跨膜压等参数，分别测试了Hollow Fiber 750KD、膜包Hydrosart 300KD（E，宽流道）、Hydrosart 300KD（ECO，窄流道）处理贴壁体系和悬浮体系澄清料液的效果。

结果如图3所示，在处理贴壁体系或悬浮体系的澄清料液时，在载量相同时Hollow Fiber750KD收率都是高于膜包的，收率可达80%以上；但是膜包的通量均优于Hollow Fiber750KD，且宽流道膜包通量高于窄流道膜包，通量影响了工艺时长，往往会进一步影响慢病毒活性。因此在超滤工艺进行耗材的选择时需要综合评估料液体积、工艺时长、工艺收率、工艺成本等因素，我们选择在层析前的超滤浓缩工艺中选择膜包Hydrosart 300KD（E），在层析后超滤置换工艺中选择Hollow Fiber750KD。

图3 中空纤维和膜包处理多批慢病毒料液的数据对比

（3） 除菌

慢病毒颗粒直径约100nm, 与除菌滤器孔径0.2μm非常接近。若料液存在病毒聚集体或杂质残留较多，会导致病毒被拦截或吸附在滤膜上降低除菌工艺收率。有研究文章报道，慢病毒料液除菌工艺的收率做到了80%以上，然而在实际操作中挑战很大。

基于前期数据积累，在本项目中，我们选用赛多利斯Sartopore 2滤器进行过滤除菌。该滤器是聚醚砜材质的双层孔径膜（0.45μm+0.2μm），相比于单层膜可以提高过滤载量。A组、B-1组和B-2组料液来自贴壁培养，收率均在60%以上，最高收率为72.3%，载量均＞50L/㎡，最高可接近100L/㎡。C组料液来自悬浮培养，工艺收率虽略低于A/B组实验，但仍保持在50%以上，载量大于60L/㎡。由此可见，慢病毒上游工艺和下游前处理工艺对最终除菌工艺的收率有明显影响，Sartopore 2除菌滤器在贴壁体系及悬浮体系慢病毒过滤除菌工艺中表现较为出色。

图4 滤器Sartopore 2在除菌工艺的优化结果

总结

在该研究中，我们将澄清滤器“膜”、超滤“膜”（中空纤维柱或膜包）以及除菌滤器“膜”接力应用，贴壁体系慢病毒下游纯化工艺中这三步工艺的综合收率已超过60%！极大地保证了慢病毒下游工艺整体收率。同时，悬浮体系收获液的下游工艺收率也得到提升。

致谢：

本项目由丽山生物提供产品料液、实验场地及设备，赛多利斯提供滤器、中空纤维/膜包及除菌滤器，丽山生物团队与赛多利斯工艺开发团队共同合作完成，感谢赛多利斯工艺开发团队的大力支持。

丽山生物作为丽山健康(山东)集团有限公司的全资子公司，拥有山东省首家由省科技厅认可的免疫细胞与基因治疗CDMO中试基地，依托山东省免疫细胞与基因治疗CDMO中试基地、济南(丽山)区域细胞组织库及细胞制备中心、基因测序与合成中心三大产业平台，聚焦免疫细胞治疗、基因治疗、干细胞与再生医学、检验检测等业务，高效赋能生物医药技术创新，为济南市生物医药产业的发展贡献坚实“丽"量。